光假说历史回顾
以前人们认为光是粒子，后来人们发现光是波，现在人们说光既是粒子又是波，这是大部分人都知道的关于光假说的概括。经典波动理论的提出为解释衍射效应等一系列微粒模型不能解释的现象提供了一种解释。但是，经典波动理论是不完备的，例如弱光照下光敏探测器噪声背景上会有明显的尖脉冲，且其出现是某种随机过程，这被称为散粒噪声，表明光是颗粒状的。光电效应更是对经典波动模型提出严峻挑战，按照波动理论，莱纳德实验中的截止能量不可能和光照强度无关，强光照应该会给电子更多能量，而且，不存在的光电流延迟表明，光中的能量不是弥散在波中，倒更像是颗粒状的。
这种结果与经典波动理论不相容，但和几个有关炽热物体发光的实验吻合。借助普朗克刚刚提出的新常数，爱因斯坦给出如下关系（普朗克-爱因斯坦关系）：
其中， 是光子能量， 是约化普朗克常数， 是光子频率。具体的公式说明这里不展开。
这一新的光假说声称：光以能量包（光子）的形式出现，来自单色光源的光子各自携带相同能量，其大小由光在光谱中的位置决定；光子与物质互相作用时，要么将其所有能量传递给单个电子，要么从电子旁边穿过，两种情况的出现随机；光子可以由单个电子产生，电子失去的能量等于新光子的能量，这种产生也是随机的。
荧光技术
原子发射光谱和原子激发光谱在原理上并没有什么差别，它们都是电子在原子不同能级之间跃迁的结果，而原子的能级是固定的。分子则不同，分子中原子核相对位置可以改变，不同的原子核相对位置导致不同的电子态的能量不同。基态时存在一个分子构型使得电子与原子核的总能量最小，那么实际的分子构型就倾向于靠近这个总能量最小的分子构型，在其附近涨落。激发光子使分子进入激发态，此时总能量最小的分子构型改变，分子构型在新的总能量最小的分子构型附近涨落。激发态总能量最小的分子构型和基态并不一致，因此当其回到基态时，出射光子频率和激发光子就存在差异，这就导致了激发光谱和发射光谱之间存在差异。孤立原子发射波长与激发波长相比没有位移，而这种激发谱和发射谱之间存在差异，其激发谱和发射谱峰值波长之差叫做斯托克斯位移。这种现象就叫做荧光，存在这种行为的分子或者分子团叫做荧光团，斯托克斯位移就是荧光团的特征量。性质良好的荧光团处于激发态时发射光子概率很大并且持续时间较长。利用荧光技术可以制造荧光显微镜。荧光的应用已经相当广泛，在此不再赘述。
双光子技术
双光子技术是建立在上面提及的新版光假说之上的。基于这一光假说，虽然其强调光子会将所有能量传递给单个电子，但电子存在吸收多个光子的可能。一篇论文指出，理论上原子和分子可以通过电子吸收多个光子来实现电子态跃迁，即使该分子的初态和末态之间不存在中间态（M. Göppert-Mayer, 1931）。实验证明，这是可行的，同时吸收两个光子，其中每个光子只有所需激发能量的一半，也可以激发荧光团。这就是双光子激发。
前述荧光技术对于厚度较大的样品，可能原本只是想照亮某一个区域，最后却照亮了整个入射带状区域。利用双光子激发技术配合激光脉冲，激光将入射光子聚集成超短脉冲，焦点外的激发迅速衰减，而焦点处则可以观察到双光子激发现象。
双光子成像可以实时记录清醒动物的神经活动，无需植入电极。同时，人们了解到激光照射能够使神经元兴奋（Fork, 1971），双光子激光照射可以比早期技术更精确聚焦激光，可以有选择性地使单一神经元兴奋。